[감염병학] 바이러스의 검사실 진단, 항바이러스제

1. 바이러스병의 검사실 진단법

2. 바이러스 배양 방법

3. 세포 배양에서 바이러스 증식을 인식하는 방법

4. 바이러스 감염력(가) 측정 방법

5. 항바이러스제

에 관해 알아보자.

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바이러스의 검사실 진단

바이러스 검체 및 진단법

 

- cytology : inclusion bodies, syncytia(cell fusion)

- electron microscopy

 

detection of viral proteins (바이러스의 단백질을 검출하는 방법)

1. protein patterns (electrophoresis) : 단백질을 전기영동으로 분리해 패턴을 비교

2. enzyme activities (ex. reverse transcriptase) : 효소 활성 측정한다.

3. hemagglutination & hemadsorption : 적혈구 응집소를 만들어내는 바이러스를 검출한다. (RBC 응집되거나 세포에 흡착)

4. antigen detection (직간접 immunofluorescence, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, radioimmunoassay, latex-agglutination, western blot) : 항원-항체 반응으로 바이러스 항원을 검출한다. 항체에 어떤 시약을 붙이느냐에 따라 다르다

  암기 : 단백질을 많이 먹어서 피하(PEHA)지방이 생겼다.

 

detection of viral genomes (바이러스의 유전체를 검출하는 방법)

1. restriction endonuclease cleavage patterns : 제한효소에 의한 유전체 절단 패턴 분석

2. electrophoresis : segmented RNA를 크기에 따라 분리

3. in situ hybridization : 조직 또는 세포(fixed tissue)에 DNA probe를 붙이고 변성시키면 labeling된 부분만 다르게 염색된다.

4. Southern(DNA), Northern(RNA), and dot blots

5. PCR (Polymerase Chain Reaction): dsDNA에 고온 변성을 가해 이중가닥을 벌리고 primer로 사슬을 연장시킨다. 이를 연쇄적으로 증폭한다.

6. Reverse Transcription PCR (RT-PCR): detects RNA

7. Real-time (quantitative) PCR (qPCR) : PCR 과정 중 형광 신호를 실시간으로 측정 → 정확한 바이러스량(viral load)을 정량

8. Genome sequencing (유전체 시퀀싱) : 바이러스 전체 RNA/DNA 염기서열을 직접 읽는 기술

 

serologic test methods

1차 항체를 직접 labeling하면 직접법, 2차 항체로 증폭하면 간접법이다. 항원-항체 반응을 사용한다.

1. hemagglutination inhibition : 혈구 응집시키는 바이러스의 경우 항체를 투여하면 RBC 응집이 일어나지 않아 가라앉는다.

2. neutralization : 바이러스 항체를 함께 투여하여 cytopathic effect가 발생하지 않는다.

 

 

바이러스 배양 방법

1. cell culture(세포) : 바이러스마다 특징적인 cytopathic effect를 관찰하며 3종류가 있다.

  - primary cell culture(in vitro에서 잘 못 자라고 비쌈)

  - diploid cell strain(single type이며 실용적)

  - continuous cell line(aneuploid한 암세포이며 잘 증식해서 주로 사용하는 방법. 장점은 IRSL ~> Indefinite and propagation by sub-culturing, Retain viability for many years when frozen, Single cell suspension, Large number)

2. embryonated eggs(계란)

3. laboratory animal(동물)

 

subculture(계대배양)은 세포가 잘 자라도록 주기적으로 환경을 바꿔주는 것

 

 

세포 배양에서 바이러스 증식을 인식하는 방법

CPE, virus-coded protein에 의한 적혈구 응집반응과 특이항원, 세포병변을 동반하지 않기도 하는 hemadsorption, virus specific nucleic acid(바이러스 특이적 핵산), 세포 배양액의 계란이나 실험동물 접종(inoculation) 등으로 인식한다.

 

cytopathic effect

세포 모양이 찌그러지거나, 사멸하거나, 세포들끼리 뭉친 합포체 syncytium이 형성되거나, 세포 안에 inclusion body가 보이거나 하는 변화를 관찰한다.

 

hemadsorption

glycoprotein인 hemagglutinin 등이 RBC를 잡아서 잘 씻겨나가지 않게 한다.

 

 

바이러스 감염력(가) 측정 방법

역가는 infectivity, 즉 감염력을 의미한다. 바이러스의 양을 측정한다.(quantification) 물리적/생물학적 방법이 있는데 후자가 중요하다.

 

physical method

1. quantitive PCR(qPCR)

2. serology

3. hemagglutination

4. direct count

 

biological method (역가 측정 방법)

1. plaque assay : colony 측정했듯이 바이러스에 의해 용해되어 구멍 뚫린 plaque 개수를 측정(PFU = plaque forming unit)한다.

2. transformation assay : 숙주세포가 형질전환(contact inhibition 사라짐)되어 무한증식하면 microtumor(focus)가 만들어진다.

3. pock assay : allatonic/chorioallatonic membrane의 hemolytic site를 확인하는 방법인데 요즘은 잘 안 쓴다.

4. end point biological assay : 바이러스 용액을 단계적으로 희석해, 반수에서 효과가 나타나는 용량(TCID50 = tissue culture infectious dose 50 ~> 50%에서 감염되어 CPE가 나타남)을 찾는다. 

  암기 : 생물학적 방법은 체육(PE)시간에 PT 받는다 ~> PTPE

 

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항바이러스제

표적바이러스와 그에 대한 항바이러스제, viral interferon에 대해 알아보자. 약리학에서 다룬 주제다.

https://parkzzang2.tistory.com/162

[약리학] 항바이러스제, 항진균제, 결핵/나병 치료제

 

항바이러스제가 개발된 바이러스 (9종류)

1. 헤르페스 : HSV, VZV, CMV

  * HSV와 VZV에는 acylclovir가 잘 듣고, CMV에는 ganciclovir가 잘 듣는다. EBV는 좀 다르다.

2. 가운데 : HIV, influenza A&B, hepatitis B&C

  * C형 간염 바이러스는 항바이러스제로 완치 가능한 대표적인 RNA virus

3. 호흡기 : RSV, adenovirus, papillomavirus

  * RSV = respiratory syncytial virus호흡기세포융합바이러스

  암기 : 항바이러스제로 바이러스 치료 시켜볼(S, C, V ~> HSV, CMV, VZV)까? 4일간(사, 인, 간 ~> 사람면역결핍, 인플루엔자AB, 간염BC) 치료하면 리얼로 아프다.(R AP ~> RSV, Adeno, Papilloma)

 

항바이러스제의 표적 (9곳)

- attachment를 막는 것은 receptor antagonist(세포 수용체 쪽)와 중화항체(바이러스랑 붙어서 조짐)가 있다. free virus blocking하는 후자가 더 낫다.

- transcription은 DNA에서 RNA를 합성하는 과정을 억제하면 숙주세포도 영향받을 가능성이 있어서 조심해야한다.

- 각 바이러스마다 replication step이 달라서 각각을 타겟으로 한다.

 

바이러스별 타겟

크게 influenza, herpes, HIV, hepatitis B&C 4종류를 본다.

1. flu : penetration&uncoating, neuramidase 단계를 억제한다.

2. herpes : viral DNA polymerase를 억제한다.

  * 헤르페스는 숙주세포의 DdRp를 이용하여 자기 자신의 viral DdDp를 만든다. 이걸 조지면 된다.

3. HIV : 온갖 단계를 차단한다.

4. hepatitis B&C : viral protein을 막거나, HCV의 경우 RNA polymerase를 억제한다.

 

HSV 잡는 acylclovir

- viral thymidine kinase가 ATP 하나 붙이고, cellular kinase가 ATP 2개 붙여서 acylclovir triphosphate가 된다.

- herpes DNA elongation 멈춘다.

 

anti-HIV

- attachment, entry(maraviroc이 억제), reverse transcriptase(nucleoside, non-nucleoside), integration(raltegravir가 억제), protease(envelope 만들어 maturation하는 과정에 필요) 온갖 과정을 막는다.

- RTase 억제는 nucleoside analog, nonnucleoside analog 모두 쓴다.

- 바이러스는 protease의 도움으로 매끈매끈해진다. 이를 block할 수도 있다.

 

anti-influenza

- 인플루엔자 바이러스는 숙주세포의 neuraminic acid와 자신의 hemagglutinin이 붙어서 못 빠져나간다. 이때 바깥의 neuromidase가 작용하여 탈출이 가능하다.(흡입하는 짜나미비르zanamivir, 경구섭취하는 오셀타미비르oseltamivir ~> 타미플루)

- 또는 matrix protein에 의한 uncoating 과정을 막는다. (아만타다인amantadine, 리만타다인rimantadine)

 

anti-HBV

- HBV는 역전사를 한다.

- viral DNA polymerase를 억제하는 라미부다인lamivudine 등

 

anti-HCV

- (+)ssRNA virus다. 

- protease inhibitor, 또는 RdRp blocking

 

interferon

5가지 기전이 있다.

1. transcription 억제

2. translation 억제 : 2, 5 oligoadenylate synthetase, protein kinase R 활성하여 바이러스 단백질 합성 억제

3. post-translational processing 억제

4. maturation 억제

5. release 억제